tgoop.com/IRBioinformatics/1331
Last Update:
هنگام لود پروتئین‌ها بر روی ژل SDS-PAGE (الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات)، توجه به نکات زیر برای اطمینان از دقت و صحت نتایج ضروری است:
1. آماده‌سازی نمونه‌ها:
هموژن‌سازی صحیح نمونه‌ها: پروتئین‌ها باید به طور کامل در بافر مناسب حل شوند. عدم حل شدن کامل پروتئین‌ها می‌تواند باعث عدم بارگذاری یکنواخت و تاثیر بر نتایج شود.
استفاده از بافر لودینگ مناسب: نمونه‌ها باید در بافر SDS-PAGE loading buffer که معمولاً حاوی SDS، گلیسین، دترجنت و ماده رنگی است، رقیق شوند. بافر باید حاوی عامل احیاء مانند DTT یا بتا-مرکاپتو اتانول برای حفظ پروتئین‌ها در حالت کاهش یافته باشد.
پایداری پروتئین‌ها: اگر پروتئین‌ها زمان زیادی در دمای اتاق قرار گیرند، می‌توانند دچار دناتوره شدن شوند. بنابراین، پروتئین‌ها باید در یخ یا در دمای پایین ذخیره شوند تا از فعالیت آنزیمی یا تخریب آنها جلوگیری شود.
2. تنظیم غلظت پروتئین:
غلیظ بودن نمونه‌ها: غلظت پروتئین‌ها باید در محدوده مناسب باشد (معمولاً 10-50 میکروگرم در هر چاهک). غلظت بالاتر از حد معمول می‌تواند باعث بارگذاری بیش از حد شده و منجر به تداخل پروتئین‌ها و نتیجه‌گیری اشتباه شود. از طرفی، غلظت خیلی کم ممکن است منجر به سیگنال ضعیف و عدم مشاهده پروتئین‌ها شود.
اندازه‌گیری دقیق غلظت پروتئین: برای اندازه‌گیری دقیق غلظت پروتئین‌ها می‌توان از روش‌های مختلفی مانند Bradford یا BCA استفاده کرد.
3. دمای نمونه‌ها:
نمونه‌ها باید قبل از بارگذاری بر روی ژل در دمای مناسب (معمولاً 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه) حرارت داده شوند تا پروتئین‌ها به طور کامل دناتوره شده و به شکل زنجیره خطی (که برای الکتروفورز مناسب است) درآیند.
4. استفاده از لودینگ صحیح:
بارگذاری یکنواخت: هنگام بارگذاری نمونه‌ها در چاهک‌های ژل، باید دقت کرد که نمونه به طور یکنواخت و بدون ایجاد حباب به داخل چاهک وارد شود. استفاده از پیپت دقیق و آرام بسیار مهم است.
پرهیز از تماس مستقیم پیپت با ژل: از تماس نوک پیپت با ژل پرهیز کنید تا از آسیب به ژل و ایجاد سیگنال‌های خطای غیرطبیعی جلوگیری شود.
5. استفاده از نشانگر وزن مولکولی (Marker):
لودینگ نشانگر وزن مولکولی: حتماً از نشانگر وزن مولکولی مناسب برای تعیین اندازه پروتئین‌ها استفاده کنید. نشانگر باید در شرایط مشابه با نمونه‌ها بارگذاری شود.
کنترل‌های مناسب: بهتر است کنترل‌هایی مانند پروتئین‌های شناخته‌شده با وزن مولکولی مشخص (مثلاً کنترل‌های مثبت و منفی) در کنار نمونه‌ها لود شود.
6. کنترل حجم بارگذاری:
حجم نمونه باید به گونه‌ای باشد که در سطح ژل به طور یکنواخت پخش شود و از هم‌پوشانی و پخش پروتئین‌ها جلوگیری کند. معمولا حجم 10-20 میکرولیتر از نمونه مناسب است.
7. ملاحظات هنگام بارگذاری پروتئین‌های غنی از لیپید یا مواد آنتی‌ژنیک:
اگر پروتئین‌ها حاوی لیپید یا آنتی‌ژن‌هایی هستند که به دلیل ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مشکل ایجاد می‌کنند، ممکن است نیاز به پیش‌درمان با مواد خاصی مانند دترجنت‌ها یا حلال‌ها برای حل کردن این ترکیبات باشد.
8. کنترل pH بافر:
اطمینان حاصل کنید که بافر لودینگ و بافر‌های دیگر (مثل بافر running buffer) دارای pH مناسب برای عملکرد صحیح باشند. معمولاً pH مناسب برای بافرها حدود 8.3 است.
9. مراقبت از ژل در حین اجرا:
از وارد کردن گرما به ژل به طور ناخواسته جلوگیری کنید. گرمای زیاد می‌تواند به ژل آسیب رسانده و نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.
با رعایت این نکات می‌توانید از دقت و صحت نتایج SDS-PAGE خود اطمینان حاصل کنید و از تداخل یا خطاهای تجربی جلوگیری کنید.
BY آکادمی بیوانفورماتیک محققان ایرانی
Share with your friend now:
tgoop.com/IRBioinformatics/1331